摘 要 以石墨烯量子点（GQDs）为还原剂和稳定剂，在其表面原位生长银纳米粒子（AgNPs），制备了具有良好分散性的GQDs/AgNPs纳米复合物，其粒径小于30 nm。GQDs/AgNPs纳米复合物具有类过氧化物酶的催化活性，能有效催化H2O2氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）并发生显色反应。稳态动力学分析表明， GQDs/AgNPs催化动力学遵循典型的Michaelis-Menten模型，其催化机理符合乒乓机制。与辣根过氧化物酶（HRP）相比，GQDs/AgNPs纳米复合物具有更强的亲和性。基于GQDs/AgNPs的催化活性和葡萄糖氧化产生H2O2的原理，建立了H2O2和葡萄糖的比色检测方法，检出限分别为0.18和1.6 μmol/L。将本方法应用于血浆中葡萄糖的检测分析，结果与标准方法相符。 
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　　关键词 石墨烯量子点-银纳米粒子复合物； 类过氧化物酶； 过氧化氢； 葡萄糖 
　　1 引 言 
　　银纳米粒子（AgNPs）是一种重要的纳米材料，在催化、电子和抗菌等领域得到广泛应用。但由于AgNPs易氧化和发生聚集，因此在实际分析应用中一般需加入稳定剂（如聚合物、有机小分子和纳米颗粒等）使其稳定存在[1]。 
　　氧化石墨烯（GO）具有优良的电子、机械和化学性能，已成为构建GO-贵金属新型复合材料中广受欢迎的基本构件。这些GO-贵金属材料在催化[2]、表面拉曼扫描[3]、抗菌[4]、电子运输[5]、制氢[6]、光学和化学传感器[7，8]等领域均表现出优良的性能。在一步光化学反应制备的GO/AgNPs复合物中，AgNPs在GO表面均匀分布，在无外加稳定剂的条件下，GO/AgNPs溶液呈现出良好的分散性及稳定性[9，10]。 
　　石墨烯量子点（GQDs）是尺寸小于100 nm的零维石墨烯纳米片，其量子限域和边界效应带来的优良荧光性能使其在光电子器件、光伏和光发射器件、生物成像、传感和电化学催化等领域广泛应用[11～13]。本研究以GQDs为还原剂，发展了一种在GQDs表面原位生长AgNPs颗粒的新方法，进而得到GQDs/AgNPs纳米复合物。GQDs在充当还原剂的同时，对原位生长的AgNPs表现出良好的稳定作用。此纳米复合物在H2O2氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）产生显色反应的过程中呈现优良的催化活性，据此构建了一种简单、快速的H2O2和葡萄糖定量检测分析方法。 
　　2 实验部分 
　　2.1 仪器与试剂 
　　H-7650型透射电子显微镜（TEM），工作电压为80 kV； U-3900紫外可见分光光度计（日本日立公司）； LabRAM XploRA全自动显微拉曼光谱仪（法国HORIBA JOBIN YVON公司）。 
　　石墨粉（南京先锋纳米材料科技有限公司）；葡萄糖（Glu）、葡萄糖氧化酶（GOx）、AgNO3、H2O2等（国药集团化学试剂有限公司）。除特别标注外，所有试剂皆为分析纯，实验用水为二次去离子水（18 MΩ cm）。 
　　2.2 GQDs/AgNPs的制备 
　　2.2.1 GQDs的制备 首先根据文献[14]的方法制备GO， 具体过程如下：将10.0 g石墨粉、10.0 g K2S2O8和10.0 g P2O5混匀后，加入30 mL浓H2SO4，80℃反应6 h。冷却至室温后用去离子水洗涤至中性，60℃真空干燥， 得到预氧化石墨。 
　　将5.0 g预氧化石墨与4.0 g NaNO3混匀，冰浴中缓慢加入184 mL浓H2SO4，控制温度在0～4℃之间。缓慢加入25.0 g KMnO4，剧烈搅拌并控制温度在10℃以下；反应1 h后，将体系升温至35℃反应30 min； 室温陈化7天。反应结束后，加入400 mL去离子水，90℃下加热15 min，滴加H2O2至悬浊液由红褐色变为亮黄色。用HCl （1∶10， V/V）充分洗涤至BaCl2检测无SO2 Symbolm4。最后用去离子水洗至弱酸性，60℃真空干燥至恒重，得到GO。 
　　取25 mg GO分散于5 mL去离子水中，与20 mL HNO3 （65%，V/V）混合后转移至聚四氟乙烯密封罐中，200℃微波消解5 min。冷却后旋转蒸发除去未反应的酸，用NaHCO3中和至中性，再用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液透析处理（500～1000 MW CO），得到GQDs。 
　　2.2.2 GQDs/AgNPs纳米复合物的制备 将0.5 mg/mL GQDs （100 mL）溶液以氨水调节至中性，并超声20 min。将浓氨水逐滴滴加到1 mL 50 mg/mL AgNO3溶液中，至溶液恰好澄清为止，得到银氨溶液。将上述两种溶液混合，100℃磁力搅拌油浴回流反应1 h，最终得到红棕色GQDs/AgNPs水溶液。 
　　为进行性能比较，研究中以0.5 mg/mL GO溶液取代GQDs溶液，按上述过程制备了GO/AgNPs纳米复合物。 
　　2.3 比色法测定H2O2和葡萄糖 
　　将340 μL HAc-NaAc缓冲液（pH 4.0），100 μL H2O2溶液，12 μL TMB溶液（25 mmol/L）和50 μL GQDs/AgNPs溶液（250 μg/mL）混和摇匀，室温下涡旋振荡反应40 min，在652 nm波长处测定溶液吸光度。 
　　葡萄糖检测时，在葡萄糖样品溶液中加入100 μL GOx，37℃条件下水浴反应30 min。后续检测过程与H2O2检测相同。 
　　3 结果与讨论 
　　3.1 GQDs/AgNPs纳米复合物的制备与表征 
　　本研究中将浓氨水加入AgNO3中得到银氨溶液，Ag（NH3）+2在静电作用下吸附到含有OH和COOH官能团的GQDs表面[9]。在100℃温度条件下，GQDs发生热还原[15]，致使Ag（NH3）+2在GQDs表面转化生成Ag0（NH3）2。生成的Ag0（NH3）2在电子供体NH3的保护下，形成低聚的Ag原子簇，并随时间延长逐渐长大，最后生长成为胶体AgNPs 。 　　图1A为GQDs的透射电镜图，粒径统计显示GQDs的平均粒径为2～7 nm，与文献[14]报导方法的结果相符。图1B为原位生长AgNPs后的GQDs/AgNPs纳米复合物的透射电镜结果，可以观察到在GQDs表面原位生成了黑色的AgNPs，插图为GQDs/AgNPs的高分辨透射电镜照片，可以清晰地看到AgNPs的晶格结构，晶格间距为0.19 nm，对应Ag纳米晶的200晶面[16]。粒径分布统计结果表明，GQDs/AgNPs纳米复合物的粒径范围为8～30 nm，比GQDs的粒径大，这是因为在GQDs表面生长了一层AgNPs纳米粒子所致。 
　　图2A是GQDs原位生长AgNPs前后的紫外-可见吸收光谱。GQDs在230 nm处有最大吸收，对应芳香环sp2杂化的π-π*跃迁。而GQDs/AgNPs纳米复合材料除230 nm处的吸收峰外，在403 nm处出现新的吸收峰，为AgNPs的表面等离子体共振特征吸收峰[16]，说明AgNPs成功原位生长于GQDs表面。 
　　由GQDs和GQDs/AgNPs纳米复合物的X射线光电子能谱（XPS）全图分析结果（图2B）可以看到，GQDs和GQDs/AgNPs谱图中均有位于284 eV处的C1s峰和532 eV处的O1s峰，但GQD/AgNPs在370 eV附近出现了Ag的特征能谱峰。从Ag3d的高分辨谱图（图2C）可以看出，GQDs/AgNPs纳米复合物中Ag的特征峰分别位于368和374 eV处，对应Ag的3d5/2和3d3/2。这两个峰差值为6.0 eV，与金属形态银的两峰理论差值相符[17]。 
　　GQDs和GQDs/AgNPs纳米复合物的拉曼光谱如图2D所示。GQDs和GQDs/AgNPs在1344和1597 cmSymbolm 1附近均出现D带和G带的特征峰。由于AgNPs的表面拉曼增强效应，GQDs/AgNPs纳米复合物D带和G带强度均明显增强；同时GQDs/AgNPs纳米复合物ID/IG的比值（1.59）远高于GQDs（0.90），说明由于GQDs还原Ag（NH3）+2过程中，GQDs表面含氧基团的消耗和AgNPs的原位生成促使GQDs表面缺陷位点增多，导致其无序程度增大。 
　　3.2 GQDs/AgNPs的催化活性 
　　以过氧化物酶底物TMB为显色底物，H2O2为氧化底物，GQDs/AgNPs为催化剂，通过监测体系中TMB氧化物在652 nm处的吸光度，考察GQDs/AgNPs纳米复合物的类过氧化物酶的催化特性；同时，考察GO/AgNPs的催化特性，H2O2浓度： 0.5 mmol/L； GO/AgNPs和 GQDs/AgNPs浓度： 250 μg/mL。 
　　Concentration of H2O2： 0.5 mmol/L； Concentrations of GO/AgNPs and GQDs/AgNPs： 250 μg/mL.并进行性能比较。GO/AgNPs和GQDs/AgNPs均可催化H2O2氧化TMB产生经典的显色反应，其氧化产物显蓝色，在652 nm处有一个特征吸收峰。GO/AgNPs和GQDs/AgNPs均表现出快速的颜色响应，这是因为石墨烯材料的芳香平面结构和表面羧基基团使其具有较强的类过氧化物酶活性[18]。但在强酸条件下，由GO割裂形成GQDs时，其边缘形成了更加丰富的羧基基团，GQDs因而呈现出更强的类过氧化物酶活性，故GODs/AgNPs在催化氧化TMB时，表现出更灵敏的催化氧化效果，在同样条件下得到更高的响应信号，如图3所示。 
　　催化反应体系的pH值和反应温度对酶催化活性产生决定性影响，本研究对这些影响因素进行了详细考察，结果如图4。当温度高于25℃时，GQDs/AgNPs的类过氧化物酶活性随温度升高而略有下降。在pH 2～4范围内，GQDs/AgNPs的催化性能随pH值增大而增强，但pH 4～6时，随着pH增大，其催化性能急剧降低，并在pH 6时完全失去催化作用。其原因可能是pH过大导致H2O2加速分解。后续研究中选择pH 4.0的HAc-NaAc缓冲液在25℃下进行反应。 
　　为分析GQDs/AgNPs的催化机理，分别通过改变体系中TMB和H2O2浓度测定了显色反应的稳态动力学参数。由图5A和5B可知，GQDs/AgNPs纳米复合物催化反应遵循典型酶催化反应历程即Michaelis-Menten动力学模型。利用Lineweaver-Burk双倒数方程1/V=Km/Vmax（1/[S]+1/Km）计算得到GQDs/AgNPs催化反应的最大反应速率Vmax和米氏常数Km， 如表1所示。GQDs/AgNPs对底物TMB和H2O2的Km与其它报道的类过氧化物酶纳米材料相当，但均远小于HRP。由于米氏常数Km可反映酶与底物之间的亲和性能， Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。上述结果说明GQDs/AgNPs对TMB和H2O2的亲和力较强。 
　　图5C和5D为不同TMB和H2O2浓度时得到的Lineweaver-Burk双倒数曲线。GQDs/AgNPs催化底物H2O2（TMB）显色反应的3条双倒数曲线基本平行。这表明以H2O2（TMB）为底物时，改变TMB（H2O2）浓度，Lineweaver-Burk双倒数的斜率基本不发生变化，只有截距随着TMB（H2O2）浓度的增大而减小。GQDs/AgNPs纳米复合物的催化反应符合乒乓机理[21]，即GQDs/AgNPs先与第一种底物结合并发生反应，且在第二种底物反应之前释放出第一种底物。 
　　3.3 分析应用 
　　基于GQDs/AgNPs纳米复合物的类过氧化物酶催化性质，建立了简单的H2O2比色定量分析方法。由图6A可见，反应生成的蓝色产物的颜色随H2O2浓度的增大而加深。在最优实验条件下，H2O2检测分析的线性曲线如图6B所示，在H2O2浓度0.5～100 μmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限为0.18 μmol/L。表2列出了一些纳米粒子作为类过氧化物酶在H2O2检测的分析性能，可以看到， GQDs/AgNPs纳米复合物的检测性能较为优良，同时相较于单一的N-GQDs体系而言，GQDs/AgNPs纳米复合物由于表面AgNPs的原位生成，导致其类过氧化物酶活性更强，因而对H2O2表现更高的检测灵敏度。 　　基于GOx能够催化葡萄糖产生H2O2，本方法也可用于对葡萄糖的分析检测。图7A为葡萄糖定量分析的标准曲线，在6～200 μmol/L范围内， 葡萄糖浓度与吸光度具有良好的线性关系，检出限为1.6 μmol/L。图7B表明葡萄糖浓度为0.2 mmol/L时，2 mmol/L果糖（Fru）、乳糖（Lac）、蔗糖（Sac）、纤维二糖（Cel）和麦芽糖（Mal）对葡萄糖测定的干扰情况。由于GOx酶催化的专一性，本方法对葡萄糖的检测具有良好的选择性。 
　　Fru： 果糖， Lac： 乳糖， Sac： 蔗糖， Cel： 纤维二糖， Mal： 麦芽糖。 
　　Fru： fructose， Lac： lactose， Sac： saccharose， Cel： cellobiose， Mal： maltose. 
　　将本方法用于人体血清样品中葡萄糖含量的分析测定，结果见表3，测定结果与标准方法的测定结果一致，说明本方法能够应用于实际样品中葡萄糖的检测分析。 
　　4 结 论 
　　以石墨烯量子点（GQDs）为还原剂和稳定剂，在其表面原位生长银纳米粒子（AgNPs），制备了GQDs/AgNPs纳米复合物。GQDs/AgNPs具有优良的类过氧化物酶催化活性，能够快速催化H2O2氧化TMB显色，其催化动力学遵循Michaelis-Menten动力学模型，催化机理符合乒乓机制。GQDs表面和边缘丰富的羧基基团，使GQDs/AgNPs较GO/AgNPs具有更强的催化性能。基于GQDs/AgNPs的酶催化活性建立了H2O2和葡萄糖的比色检测方法，可成功用于血样中葡萄糖的测定。GQDs表面原位生长纳米粒子的方法不仅为纳米粒子的稳定制备提供了一种有效方案，并为进一步拓展GQDs的应用范畴和调控其光学性能提供了新思路。 
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